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细胞学堂|THP-1细胞培养攻略, THP-1细胞培养的常见问题与解决方法

来源:Procell  浏览量:  发布时间:2021-11-30 10:53:42

THP-1巨噬细胞是1980年Tsuchiya等人建立的人单核细胞白血病细胞系。它来自一位急性单核细胞白血病患者的血液,有分化为多种巨噬细胞的能力,是各领域研究常用的细胞系之一。

THP-1细胞基本信息

THP-1细胞基本信息

▲产品详情  细胞系: THP-1  培养基: CM-0233

 

THP-1细胞的特点

1.    喜欢酸性环境

在偏酸性环境中,THP-1巨噬细胞生长更快,所以当培养基稍微变黄(呈橘红色)时,是适合细胞生长的,此时补液或半换液即可。(详细操作见下文换液篇)

2.    有密度依赖性

THP-1细胞密度低时,生长较慢,培养密度维持在50万-100万细胞/毫升为宜;超过200万/毫升则需要传代。

3.    对血清要求高

选择品质好的血清更有利于THP-1细胞生长

THP-1生长图片

THP-1巨噬细胞生长图片


THP-1细胞培养攻略之收货篇

1.    常温细胞:收到THP-1细胞后,放进培养箱静置2-4小时,之后将瓶中培养基全部离心(1200rpm或250g,3分钟),去上清,用适量新鲜培养基重悬细胞,按比例接种到新培养瓶中。

2.    冻存细胞:收到THP-1细胞后,如果不复苏,放进-80℃冰箱暂存或放进液氮长期保存。如果复苏,按照常规复苏步骤操作(见下文复苏篇)即可。

小贴士:由于THP-1细胞有密度依赖,将培养瓶竖着放进培养箱(瓶盖朝上),可以增加细胞局部密度,从而促进细胞生长,注意瓶盖要保持透气。

常温THP-1细胞,收货处理示意图

常温THP-1细胞,收货处理示意图


THP-1细胞培养攻略之换液篇

1.    补液法:培养基变黄时可补加适量(1~2mL)新鲜培养基,补加1-2次之后,用离心的方式全部换液,离心1200rpm (约250g)3分钟。

2.    半换液法:以T25瓶子为例,瓶子里装有5mL培养基。竖起瓶子静置一段时间,待细胞沉底(以肉眼观察到沉底为限),小心吸出2.5mL的培养基,转移到离心管,离心1200rpm (约250g)3分钟,检查有没有沉淀,以免损失细胞;原瓶补充2.5mL新鲜培养基,离心管里若有细胞,则用新鲜培养基重悬后放回原瓶。

小贴士:如果换液后第二天培养基就变得很黄,同时镜下检查未污染,说明细胞密度大,该传代了。

半换液操作示意图

半换液操作示意图


THP-1细胞培养攻略之传代篇

1.    直接分瓶法:摇晃培养瓶,把细胞摇匀,均分到两个瓶子里,每瓶再补充等量培养基;

2.    离心法:离心后计数,按照40-50万细胞/mL的密度接种到T25瓶里,瓶中培养基量以5mL为宜。不方便计数时,按1:2比例传代。

小贴士:细胞碎片较多的情况下,建议用离心法传代,离心转速可适当降低(推荐800~1000rpm或160~200g)。

THP-1细胞传代时机

THP-1细胞传代时机


THP-1细胞培养攻略之冻存篇

冻存步骤:

Step1:预先配制好冻存液

Step2:细胞1200rpm(约250g)3分钟离心后

Step3:去上清,用配好的冻存液重悬细胞

Step4:转移入冻存管

Step5:冻存管放进程序冻存盒

Step6:冻存盒放进-80度冰箱过夜,再放液氮长期保存

小贴士:

1.    由于THP-1是悬浮细胞,更易受到冻存影响,建议加大冻存密度,大约200万-300万/mL为宜,以提高复苏存活率。

2.    没有程序降温盒的同学,可以选择非程序冻存液(使用前咨询试剂商是否适用于THP-1细胞),或者按照【4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃ 过夜→液氮保存】的顺序手动梯度降温。

 

THP-1细胞培养攻略之复苏篇

复苏步骤:

Step1:预热水浴锅至37℃

Step2:准备一个15mL离心管,加入2-3mL左右完全培养基待用

Step3:将细胞从-80℃冰箱或液氮中取出后,放进一次性PE手套中,立即投入水浴锅,迅速用力摇晃管子,使其1分钟内融化

Step4:酒精擦拭冻存管,进入生物安全柜,把融化的细胞悬液缓慢滴加到步骤2准备好的离心管中

Step5:1200rpm(约250g)离心3分钟

Step6:同时准备1个新的T25培养瓶,加入5mL完全培养基

Step7:去上清,新鲜培养基重悬细胞后滴加到步骤6的培养瓶里,放入培养箱

小贴士:THP-1细胞复苏后通常需要3-5天恢复状态,建议复苏后48小时内不要进行操作。

 

常见问题及解决方案

Q: 收货时细胞出现伪足,或是碎片较多怎么办?

A:受到运输影响,悬浮细胞会短暂性出现形态改变的现象,如伪足等。通过传代培养,1周左右可以恢复正常。一些细胞在运输途中死亡而产生碎片,通过传代离心可以去除(见上文传代篇)。

Q:THP-1细胞培养过程中细胞发生贴壁怎么办?

A: 少量细胞贴壁属于正常情况,将细胞悬液转移至新瓶中即可。当贴壁细胞的比例高于20%,说明细胞生长环境有异常,需排查培养箱设置、培养基成分,以及培养器皿是否异常。

Q:THP-1细胞培养过程中细胞发生聚团怎么办?

A:少量细胞聚团,呈葡萄串状,属于正常现象,特别是细胞密度较低时,易出现这种情况。更换血清品牌或增大血清比例(不超过20%)有助于解决聚团问题。不建议将聚团的细胞吹散,等待密度高时,会自己分散开。

 

Q:培养基里一定要加β-巯基乙醇吗?

A:β-巯基乙醇是一种常用的培养补充剂,有抗氧化的作用,可减少氧化应激对THP-1细胞的影响。当细胞密度过大但需要维持时,可适当增加巯基乙醇的比例(不超过标准量的1.5倍)。

Q:镜下观察时,难以聚焦或估算密度怎么办?

A:悬浮细胞会随着液体流动,不容易聚焦,静置5-10分钟使细胞沉底,之后在轻轻放上显微镜观察,将有助于聚焦和估算细胞密度。

严重聚团的THP-1细胞

严重聚团的THP-1巨噬细胞

(该图为客户提供,仅供参考)

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